일단 제가 가지고 있는 샘플은 플라스미드의 상태로 두 가지가 있는데
1) 하나는 특정 프로모터를 가지고 있는 (PCR 증폭한) T easy 플라스미드이고
2) 다른 하나는 특정 유전자-IRES-EGFP가 연결되어있는 pEGFP-N1 입니다.
목표는 1)의 프로모터를 2)의 유전자들 앞에 (기존의 CMV 사용하지 않고) 끼워넣는 것입니다.
제가 지금까지 계획하고 실험해 본 strategy로는 아래의 두 가지가 있습니다.
A. 가장 쉬운 절차는 양쪽의 EcoR1 enzyme site를 사용하여 1)에서 프로모터를 잘라서 2)에 넣는 건데
이게 잘 안됩니다. CIAP를 처리하고 해봐도 잘 안됩니다.
방향이 잘못 들어가는 것을 생각해서 제대로 들어간 것을 찾으면 되겠으나
일단 잘 안되는 상태입니다..
B. 그리고 다른 절차가 있는데 이것은 1)의 프로모터를 양쪽을 다르게 (하나는 sticky end, 다른 하나는 blunt end) 잘라서
2)에 넣는 것입니다.
ligation이 잘 된다면 방향성은 문제가 없을 것이나 잘 안됩니다..
일단 저는 최종 목표는
프로모터-특정유전자-IRES-EGFP-polyA 상태로 만들면 좋으나
프로모터-특정 유전자- polyA 상태만 만들면 되므로 IRES나 EGFP는 없어도 상관은 없습니다.
이런식으로 실험을 진행하였으면 하는데 이런 클로닝을 제노마인에 의뢰를 해도 되는지요.
의뢰를 한다면 가격은 얼마나 되는지도 알고 싶습니다.
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