답변 감사합니다.
앞으로 primer design에 참고 하겠습니다.
그리고 저는 보통 primer를 물에 녹여 쓰는데 TE buffer에 녹여 쓰는게 더 좋은지요?
올리고합성팀 님의 원본글
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여러가지 주의사항은 있습니다. 하지만 저희 올리고사업팀은 어떠한 시퀀스가 있다하더라고 합성을 해낼수가 있습니다.
primer design 에서 ABC 라고 할수 있는 점은 반복서열을 많이 사용하지 않아야 하는것입니다.
1) purine 계열의 반복서열 디자인 ----> Depurination
올리고 합성에서는 3% trichloroacetic acid(매우강한 산)을 이용하게 되는데 산성조건하에서는 purine base(특히 adenosine인 경우) 과 sugar ring 사이결합이 끊어지는 depurination 반응이 일어날수있어 올리고합성이후 문제점을 야기 할수 있습니다. 특히 연속적인 AAAAAAA 가 많이 포한된 서열에서는 오류가 발생할수 있으며,
단순희 PCR 이 되지않는다고하는 경우 3'쪽의 방향으로 adenosine 서열들에서의 depurination이 일어났을수도 있습니다.
이러한 문제를 극복하기 위해, 합성에서 사용되는 강산 3% trichloroacetic acid ,약산 dichloroacetic acid 을 병행사용하고 있으며 합성기의 프로그램을 이용하여 완벽히 합성을 해결하고 있습니다.
하지만 이러한 점을 고려하지않은 올리고의 디자인에서는 문제점이 발생할수있습니다.
DNA의 경우는 acidic한 조건에서는 depurination에 의해decompose될 수 있으니
pH를 낮추지 말아야 합니다. 대분분의 경우 중성 pH의 H2O를 사용하고 계시고 있으니 이러한 문제는 없을것 입니다.
하지만 대상 sample에서 발생하는 문제를 극복하시고, purity가 높은 sample을 올리고와 반응시켜 사용하시는 주의는 있어야 하겠습니다.
2) G 가 많은 서열 디자인
hairpin 현상및 self-dimer형성 혹dms hetro dimer형성문제는 디지인을 통해 해결한뒤 실험에 임해주십시오.
GGGGGGCCCCCC 이러한 예인 올리고 cccGGG Sam I을 간진 Primer의 경우 컬럼정제가 힘들게 됩니다. 물론 합성에서도 처음 scale 보다 회수량이 적을 뿐아니라
PCR 과정에서도 조금의 주의를 요하고 있습니다.
hairpin 현상은 5' 부분에서 형성될경우 가급적 PAGE정제를 권하고 있습니다. 이런경우 PAGE정제를 할경우 좋은 결과를 얻게 됩니다.
여러번 제품을 납품하여 얻은결과로 GC % 60% 이상의 경우에는 PAGE정제를 하셔야 좋을 결과를 얻게 되실겁니다.
3) 이 외에 화학적반응에 문제점이나 사용하시는 taq의 문제점입니다.
일반적으로 염기 'G''는 enol tautomer인 2,6-diaminopurine으로 전환될 수도 있으며, 이 경우 DNA polymerase에 의해 'A'로 인식됩니다.
따라서, modified base를 포함한 oligonucleotide를 갖는 clone은 'G'가 'A'로 치환된 결과를 얻을 수 있습니다.
합성상에서 오류가 포함될 확률을 가진 부분입니다.
이러한 오류가있으므로 전 세계 올리고하우스에서 100%의 올리고는 만들어내지못한다는 입장을 표명하고 있습니다.
또한 , 이러한 경우는 실험실에는 충분히 test 된 taq을 이용하시기 때문에 문제가 발생하지 않을 것으로 예상됩니다. 하지만
주의를 요하는 부분이기도 합니다.
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